Een analysecertificaat lezen: HPLC en massaspectrometrie in gewone taal

De drie delen van een analysecertificaat

Een analysecertificaat, in het Engels certificate of analysis of kortweg CoA, is het meetrapport van één productiepartij. Bij peptiden is het voor een koper meestal de enige manier om te zien wat er in een flesje zit. Wie een CoA leert lezen, heeft er daarna een paar minuten voor nodig. De meeste certificaten bestaan uit drie delen:

• De kop. Productnaam, vaak met sequentie of molecuulformule, het batch- of lotnummer, de datum van de analyse en het laboratorium. Dit deel koppelt het papier aan een fysiek flesje.
• De uitslagentabel. Per test een regel met de methode, de verwachte waarde of eis en de gemeten uitkomst. Soms staan er ook uiterlijk, watergehalte of netto peptidegehalte bij.
• De bijlagen. Het HPLC-chromatogram en het massaspectrum: de ruwe grafieken waar de getallen uit de tabel vandaan komen. Zonder die grafieken neem je de getallen op goed vertrouwen aan.

Begin altijd bij de kop. Een prachtige uitslag is waardeloos als het lotnummer niet overeenkomt met je flesje, of als het certificaat over een ander peptide gaat.

HPLC in gewone woorden

HPLC staat voor high-performance liquid chromatography. Een opgelost monster wordt onder hoge druk door een dunne kolom met een fijn gepakt materiaal geperst. Elk soort molecuul hecht zich onderweg even aan dat materiaal, het ene langer dan het andere, waardoor de stoffen na elkaar naar buiten komen. Vergelijk het met hardlopers die op een modderig parcours uit elkaar worden getrokken.

Een detector meet aan het eind hoeveel ultraviolet licht er wordt geabsorbeerd en zet dat uit tegen de tijd. Zo ontstaat het chromatogram: een lijn met pieken. Het moment waarop een piek verschijnt, heet de retentietijd; de oppervlakte onder een piek is een maat voor de hoeveelheid van die stof.

Het zuiverheidspercentage is de oppervlakte van de hoofdpiek gedeeld door die van alle pieken samen. Bij 99% neemt het gewenste peptide 99% van het gemeten signaal voor zijn rekening en de nevenpieken samen de overige 1%.

Wat 99% niet betekent

Het is geen percentage van het poeder in je flesje, want water en zouten tellen in deze berekening niet mee. Het zegt ook niet welke stof de hoofdpiek vormt: een verkeerd peptide kan net zo netjes één piek geven. En een verontreiniging die tegelijk met het hoofdproduct uit de kolom komt, verdwijnt onzichtbaar in de hoofdpiek.

De retentietijd alleen bewijst evenmin iets, tenzij het lab een referentiestof onder precies dezelfde omstandigheden heeft gemeten. Voor de identiteit is een tweede techniek nodig.

Zuiverheid is geen netto peptidegehalte

Een gevriesdroogd peptide is nooit alleen peptide. Het poeder bevat ook water, omdat het vocht uit de lucht aantrekt, en tegenionen: kleine zure moleculen die aan de positief geladen delen van de keten gebonden zitten.

Het bekendste tegenion is TFA, trifluorazijnzuur, dat bij het maken en zuiveren van peptiden wordt gebruikt. Sommige producenten wisselen het om voor acetaat. Hoe meer basische aminozuren een peptide heeft, zoals lysine en arginine, hoe meer tegenionen er kunnen binden.

Het netto peptidegehalte is het deel van het gewicht dat echt uit peptide bestaat. Het wordt apart bepaald, bijvoorbeeld met een aminozuuranalyse of een stikstofbepaling, en het watergehalte met een Karl Fischer-titratie. Een rekenvoorbeeld met aangenomen waarden: 10 mg poeder met een netto peptidegehalte van 80% bevat 8 mg peptide, ook bij een HPLC-zuiverheid van 99%.

Veel certificaten voor onderzoekspeptiden vermelden alleen de zuiverheid. Dat is niet fout, maar wel goed om te weten als een concentratie precies moet kloppen.

Massaspectrometrie: klopt de identiteit?

Een massaspectrometer weegt moleculen. Het monster wordt eerst geïoniseerd, vaak met elektrospray (ESI): de peptiden nemen daarbij een of meer protonen op en krijgen een positieve lading. Het apparaat meet vervolgens niet de massa zelf, maar de verhouding tussen massa en lading, de m/z-waarde.

Met één proton erbij verschijnt een peptide net boven zijn eigen massa: BPC-157 (1419,5 Da) geeft dan een piek rond 1420,5. Draagt hetzelfde molecuul twee protonen, dan wordt de massa door twee gedeeld en ligt de piek rond 710,8.

Grotere peptiden nemen gemakkelijk drie, vier of meer protonen op en verschijnen daardoor bij veel lagere m/z-waarden dan hun massa doet vermoeden. Semaglutide (4113,6 Da) vind je bijvoorbeeld rond 1372,2 met drie ladingen en rond 1029,4 met vier. Een goed certificaat rekent die pieken terug naar één massa en zet die naast de verwachte waarde.

Kleine verschillen tussen verwacht en gemeten zijn normaal. Grotere verschillen hebben vaak een herkenbare oorzaak:

• Enkele tienden tot een paar dalton: meetnauwkeurigheid, of het verschil tussen de monoisotopische en de gemiddelde massa, dat bij grote peptiden oploopt.
• 22 hoger: een natriumion in plaats van een proton; een effect van de ionisatie, geen andere stof.
• 16 hoger: een extra zuurstofatoom, meestal door oxidatie van methionine of tryptofaan.
• Een bouwsteen lager: een deletievariant, bijvoorbeeld 57 Da minder bij een ontbrekend glycine of 97 Da bij proline.

Verwachte massa's van bekende peptiden

Met deze tabel controleer je of de massa op een certificaat bij het juiste peptide hoort. Het gaat om de gemiddelde molecuulmassa; een meting in hoge resolutie kan een iets lagere, monoisotopische waarde geven.

Twee namen verdienen extra aandacht. Onder de naam TB-500 worden zowel het korte fragment als het volledige thymosine bèta-4 verkocht; de massa op het certificaat laat zien welke van de twee je hebt. Bij CJC-1295 scheelt de DAC-staart bijna 280 Da, genoeg om de versies met en zonder DAC direct uit elkaar te houden. Bij GHK-Cu is het koperion in de massa meegerekend.

Rode vlaggen op een certificaat

Een nietszeggend of vervalst certificaat herken je vaak aan wat er ontbreekt. Wees extra kritisch bij deze signalen:

• Geen lotnummer. Dan is het document aan geen enkel flesje te koppelen.
• Eén certificaat voor elke batch. Is het document bij elke bestelling en elk jaar hetzelfde, dan beschrijft het hooguit ooit één geteste partij.
• Een afgesneden chromatogram. Een grafiek die vlak na de hoofdpiek ophoudt, of waarvan de assen zijn weggeknipt, kan nevenpieken verbergen.
• Ronde getallen zonder curve. 99,0% of 100% zonder chromatogram of spectrum is een bewering, geen meting.
• Geen naam van een lab. Een logo of de naam van de webshop zelf is geen testlaboratorium.
• Dezelfde grafiek bij verschillende producten. Twee peptiden met identieke pieken op hetzelfde tijdstip wijzen op knip- en plakwerk.

Accreditatie: wat ISO 17025 wel en niet zegt

ISO/IEC 17025 is de internationale norm voor test- en kalibratielaboratoria. Een lab met deze accreditatie heeft laten toetsen dat het vakkundig en herleidbaar meet. In Nederland verleent de Raad voor Accreditatie die erkenning, in België BELAC.

Twee kanttekeningen. Een accreditatie geldt voor specifieke methoden, de scope; kijk dus of de HPLC- of massabepaling van peptiden daar echt onder valt. En accreditatie zegt iets over het lab, niet over de vraag of het geteste monster uit jouw batch kwam: dat blijft de rol van het lotnummer.

Een lab zonder accreditatie kan goed werk leveren, maar dan moet je meer op vertrouwen aannemen. Een naam, een adres en een rapportnummer die je kunt nagaan, maken elk certificaat sterker.

Het juiste certificaat opvragen

De meeste webshops sturen een certificaat mee of zetten het online. Krijg je het niet, of twijfel je of het bij jouw flesje hoort, vraag er dan gericht om. Een bruikbaar verzoek noemt:

1. het product en de hoeveelheid per flesje, bijvoorbeeld 10 mg;
2. het lotnummer van je etiket, of de vraag welk lot er nu wordt verzonden;
3. het volledige certificaat als pdf, met chromatogram en massaspectrum;
4. de naam van het laboratorium dat de metingen deed.

Een verkoper die snel het passende document stuurt, laat zien dat de administratie op orde is. Een algemeen voorbeeld of een certificaat van een ander product is ook een antwoord.

King Peptides zet de analyserapporten, met batchnummer, HPLC en massaspectrometrie, voor bijna alle producten op een eigen labpagina; de opgegeven zuiverheid ligt op 98% of hoger, bij de meeste producten op 99% of meer. Ook daar leg je het nummer op het certificaat naast dat op je flesje. KoopPeptiden.com is verbonden aan King Peptides; wat je verder nagaat bij een bestelling, staat in de gids peptiden kopen.

Veelgestelde vragen

Wat betekent CoA?

CoA staat voor certificate of analysis, in het Nederlands analysecertificaat. Het is het meetrapport van één productiepartij, met onder meer de zuiverheid en de gemeten massa.

Is een zuiverheid van 98% een probleem?

Niet per se, maar 2% van het signaal komt dan van andere stoffen, vaak verwante peptideketens. Voor onderzoekspeptiden geldt 99% of meer als gebruikelijke lat, en een kloppend lotnummer en een kloppende massa wegen minstens zo zwaar.

Waarom wijkt de gemeten massa een fractie af van de tabel?

Door meetnauwkeurigheid, afronding en het verschil tussen monoisotopische en gemiddelde massa. Een afwijking van enkele tienden is normaal; een verschil van 16 of 22 Da heeft meestal een aanwijsbare oorzaak.

Hoe lang blijft een certificaat geldig?

Een certificaat beschrijft het monster op de dag van de analyse. Daarna bepalen opslag en transport of het peptide zo blijft; lees daarover peptiden oplossen en bewaren.

Kan ik een peptide zelf laten nameten?

Ja, verschillende analytische laboratoria meten peptiden op aanvraag, meestal met HPLC en massaspectrometrie. Dat kost geld en een deel van het monster, maar levert een tweede meting op, los van de verkoper.